Prime assembly: DNA χωρίς θραύσεις χρωμοσωμάτων

Η επεξεργασία του γονιδιώματος είναι εδώ και χρόνια αποτελεσματικότερη στις μικρές διορθώσεις παρά στην εισαγωγή μεγάλων τμημάτων νέου DNA. Τεχνολογίες όπως το prime editing μπορούν να ξαναγράψουν μεμονωμένα «γράμματα» του γενετικού κώδικα με μεγάλη ακρίβεια, δυσκολεύονται όμως όσο μεγαλώνει η έκταση της επιθυμητής αλλαγής. Παράλληλα, πολλές μέθοδοι για την ενσωμάτωση μεγαλύτερων τμημάτων DNA βασίζονται στη σκόπιμη κοπή και των δύο κλώνων ενός χρωμοσώματος, μια ισχυρή αλλά αδρή προσέγγιση που μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητες διαγραφές, αναδιατάξεις ή λανθασμένες ενώσεις των άκρων του DNA. Μια μελέτη στο Nature, που δημοσιεύθηκε στις 16 Σεπτεμβρίου, περιγράφει μια μέθοδο που ονομάζεται prime assembly και γεφυρώνει αυτό το κενό: χρησιμοποιεί τον μηχανισμό του prime editing για να ενσωματώσει DNA που παρέχεται εξωτερικά και να προκαλέσει μεγάλες αναδιατάξεις των χρωμοσωμάτων, χωρίς σκόπιμη διπλή θραύση των κλώνων μέσω νουκλεάσης.

Ένα παλιό εργαλείο με νέες δυνατότητες

Το κλασικό prime editing λειτουργεί σαν βιολογική «αναζήτηση και αντικατάσταση». Μια τροποποιημένη πρωτεΐνη Cas9 προκαλεί εγκοπή στον έναν κλώνο του DNA σε προκαθορισμένη θέση, ενώ ένα ένζυμο που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση αντιγράφει ένα σύντομο πρότυπο από ένα RNA-οδηγό απευθείας στο χρωμόσωμα. Η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για διορθώσεις μεμονωμένων βάσεων και μικρές εισαγωγές, παρουσιάζει όμως περιορισμούς όταν το φορτίο μεγαλώνει, επειδή το RNA-οδηγός πρέπει να κωδικοποιεί ολόκληρο το πρότυπο και οι μεγαλύτερες προεκτάσεις γίνονται ασταθείς (η πρωτότυπη μελέτη για το prime editing).

Το prime assembly χωρίζει τη διαδικασία σε δύο ρόλους. Ο επιμελητής εξακολουθεί να προκαλεί εγκοπή στον έναν κλώνο και να εισάγει σύντομες αλληλουχίες στο χρωμόσωμα, οι οποίες λειτουργούν πλέον ως σημεία σύνδεσης για ένα μεγαλύτερο τμήμα DNA-δότη που παρέχεται ξεχωριστά. Το RNA-οδηγός καθορίζει τη θέση της ενσωμάτωσης, ενώ το DNA-δότης περιέχει το τμήμα που θα εισαχθεί. Καθώς η Cas9 προκαλεί εγκοπή μόνο στον έναν κλώνο και δεν τέμνει και τους δύο, η μέθοδος αποφεύγει τους κινδύνους που συνεπάγεται η πλήρης διάρρηξη ενός χρωμοσώματος (Nature).

Η διάκριση έχει σημασία και για έναν ακόμη λόγο. Πολλές μέθοδοι εισαγωγής μεγάλων τμημάτων DNA βασίζονται στην επιδιόρθωση που κατευθύνεται από ομολογία, μια κυτταρική διαδικασία η οποία περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό στα κύτταρα που διαιρούνται ενεργά. Η ερευνητική ομάδα έδειξε ότι το prime assembly λειτουργεί σε κύτταρα που δεν διαιρούνται, καθώς και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα, δηλαδή κύτταρα του τύπου που απομονώνονται απευθείας από ασθενείς αντί να καλλιεργούνται επ’ αόριστον στο εργαστήριο. Πολλοί από τους κυτταρικούς τύπους που ενδιαφέρουν περισσότερο την κλινική έρευνα, όπως ορισμένα κύτταρα του ανοσοποιητικού ή ιστοί που διαιρούνται σπάνια, ήταν δύσκολοι στόχοι για την επεξεργασία που βασίζεται σε ενσωμάτωση (Nature).

Τι έδειξε ότι μπορεί να κάνει

Η μελέτη εξετάζει τρεις κατηγορίες γονιδιωματικής τροποποίησης: την επανακωδικοποίηση εξονίων, την εισαγωγή διαγονιδίου και τις γονιδιωματικές αναδιατάξεις κλίμακας μεγαβάσεων. Αξίζει να σταθούμε στην επανακωδικοποίηση των εξονίων. Το εξόνιο είναι τμήμα ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μέρος μιας πρωτεΐνης. Πολλές γενετικές ασθένειες οφείλονται σε μεταλλάξεις που βρίσκονται σε διαφορετικά σημεία του ίδιου εξονίου. Αντί να σχεδιάζεται ξεχωριστή διόρθωση για κάθε παραλλαγή, η αντικατάσταση ολόκληρου του εξονίου με ένα υγιές αντίγραφο αναφοράς θα μπορούσε να επιτρέψει σε έναν μόνο μοριακό σχεδιασμό να αντιμετωπίζει πολλαπλές μεταλλάξεις σε αυτό το τμήμα (Nature). Η συγκεκριμένη δυνατότητα επιδείχθηκε σε κύτταρα και δεν αποτελεί θεραπεία για κάποια ασθένεια.

Υπάρχουν ήδη αρκετές άλλες στρατηγικές ενσωμάτωσης χωρίς διπλή θραύση του DNA. Το TwinPE συντονίζει δύο RNA-οδηγούς σε αντίθετους κλώνους. Το PASTE εγκαθιστά μια θέση ανασυνδυασμού και επιστρατεύει μια ιντεγκράση. Οι Bridge recombinases χρησιμοποιούν εντελώς διαφορετική χημεία που καθοδηγείται από RNA. Μια ξεχωριστή ερευνητική ομάδα δημοσίευσε τον Αύγουστο στο Nature Biotechnology μια μέθοδο που ονομάζεται επίσης «prime assembly», με συγγενική αλλά διακριτή στρατηγική. Καμία από αυτές τις προσεγγίσεις δεν έχει συγκριθεί σε απολύτως αντίστοιχες συνθήκες, επομένως είναι πρόωρο να καταταγούν ως προς την αποδοτικότητα ή την ποιότητα των προϊόντων τους.

Αυτό που ξεχωρίζει τη μελέτη του Σεπτεμβρίου στο Nature είναι ο συνδυασμός τεσσάρων χαρακτηριστικών: προγραμματιζόμενη στόχευση, φορτίο DNA μεσαίου έως μεγάλου μεγέθους που παρέχεται εξωτερικά, λειτουργία σε κύτταρα που δεν διαιρούνται και πειραματική επίδειξη σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα.

Τι σημαίνει και τι δεν σημαίνει

Πρόκειται για αποτέλεσμα εργαστηριακής έρευνας, το οποίο έχει αξιολογηθεί από ομοτίμους. Κανένας ασθενής δεν έχει λάβει θεραπεία και δεν υπάρχουν δεδομένα για την ασφάλεια στον άνθρωπο. Με βάση τα διαθέσιμα στοιχεία, παραμένουν χωρίς ποσοτικοποίηση η ακρίβεια στο σημείο της επεξεργασίας, η εκτός στόχου ενσωμάτωση και οι μακροπρόθεσμοι κίνδυνοι. Η αποφυγή μιας διπλής θραύσης των κλώνων περιορίζει έναν γνωστό κίνδυνο, χωρίς να απαλλάσσει τη διαδικασία από πιθανά σφάλματα.

Το prime assembly έχει ενσωματώσει DNA που παρέχεται εξωτερικά και έχει προκαλέσει μεγάλες αναδιατάξεις των χρωμοσωμάτων σε κύτταρα που δεν διαιρούνται και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα, χωρίς σχεδιασμένη διπλή θραύση των κλώνων μέσω νουκλεάσης. Το prime editing ξεκίνησε ως εργαλείο για μικρές διορθώσεις, όμως η συγκεκριμένη εργασία δείχνει ότι μπορεί να πραγματοποιήσει τροποποιήσεις μεγάλης κλίμακας, οι οποίες μέχρι σήμερα απαιτούσαν πιο αδρές τομές. Η μετατροπή αυτής της δυνατότητας σε ιατρική εφαρμογή είναι ξεχωριστό και πολύχρονο εγχείρημα, όμως η τεχνική δυνατότητα που επιδείχθηκε είναι νέα και πραγματική.