Прайм асемблиране вмъква ДНК без разрези

Геномното редактиране отдавна се справя по-добре с малки корекции, отколкото с вмъкването на дълги участъци нова ДНК. Технологии като прайм-редактирането могат да променят отделни генетични „букви“ с висока точност, но се затрудняват, когато желаната промяна стане по-дълга. Междувременно много методи за интегриране на по-големи ДНК фрагменти разчитат на умишлено разрязване на двете вериги на хромозомата. Този мощен, но груб подход може да причини нежелани делеции, пренареждания или неправилно свързване на краищата на ДНК. Статия в Nature, публикувана на 16 септември, описва метод, наречен прайм асембли, който запълва тази празнина: той използва механизма на прайм-редактирането, за да интегрира предварително предоставена ДНК и да създава големи хромозомни преустройства, без умишлено да предизвиква двуверижно разкъсване от нуклеаза.

Старият редактор получава нови възможности

Стандартното прайм-редактиране работи като биологична функция „търси и замени“. Модифициран протеин Cas9 разрязва едната ДНК верига на предварително избрано място, а ензимът обратна транскриптаза копира кратък шаблон от направляваща РНК директно в хромозомата. Подходът работи добре при поправки на отделни генетични букви и малки вмъквания, но се затруднява с по-големи фрагменти, защото направляващата РНК трябва да съдържа целия шаблон, а дългите добавени последователности стават нестабилни (оригиналната статия за прайм-редактирането).

При прайм асембли задачата е разделена на две. Редакторът отново разрязва едната верига и записва кратки последователности в хромозомата, но те вече служат като точки за свързване с отделно внесен по-голям фрагмент донорна ДНК. Направляващата РНК определя мястото на интеграция, а донорната ДНК съдържа това, което ще бъде вградено. Тъй като Cas9 разрязва само едната верига, методът избягва рисковете, свързани с пълното прерязване на хромозомата (Nature).

Това разделение е важно и за клетките, в които методът може да се използва. Много подходи за големи вмъквания разчитат на хомоложно насочено възстановяване — клетъчен процес, който до голяма степен протича само в активно делящи се клетки. Според статията екипът е показал, че прайм асембли работи и в неделящи се клетки, както и в първични човешки клетки — такива, изолирани директно от пациенти, а не отглеждани неограничено в лаборатория. Много от клетъчните типове, които клиницистите биха искали да редактират, включително определени имунни клетки и тъкани, които рядко се делят, досега са били трудни мишени за редактиране чрез интеграция (Nature).

Какво показва методът

Статията съобщава за три типа геномни манипулации: прекодиране на екзони, вмъкване на трансген и геномни преустройства в мащаб от мегабази. Екзонът е участък от ген, който кодира част от белтък. Много генетични заболявания са свързани с мутации, разпръснати в един и същ екзон. Вместо да се проектира отделна корекция за всеки вариант, замяната на целия екзон със здраво референтно копие би могла да позволи една молекулярна конструкция да обхване няколко мутации в този участък (Nature). Това е демонстрирано като възможност в клетки, а не като лечение на конкретно заболяване.

Съществуват и други стратегии за интеграция без двуверижно разкъсване. TwinPE координира две направляващи РНК по противоположните вериги (Nature Biotechnology). PASTE вмъква място за рекомбинация и привлича интеграза (Nature Biotechnology). Bridge recombinases използват изцяло различна химия, насочвана от РНК (Nature). През август друг екип публикува в Nature Biotechnology метод, също наречен „prime assembly“, който използва сходна, но различна стратегия (Nature Biotechnology). Нито един от тези подходи не е сравняван при еднакви условия, затова е преждевременно да бъдат подреждани по ефективност или качество на получения продукт.

Това, което отличава септемврийската публикация в Nature, е съчетанието, което авторите съобщават: програмирано насочване, интеграция на външно предоставена ДНК със среден до голям размер, работа в неделящи се клетки и демонстрации в първични човешки клетки.

Какво означава и какво не означава

Това е лабораторен резултат, преминал научна рецензия. Няма лекуван пациент и няма данни за безопасност при хора. Прецизността на продукта в мястото на редактиране, интеграцията извън целевото място и дългосрочните рискове остават неоценени в публично достъпните данни. Избягването на двуверижно разкъсване намалява един известен риск, но не прави процеса безгрешен.

Прайм асембли е интегрирал външно предоставена ДНК и е създал големи хромозомни преустройства в неделящи се и първични човешки клетки, без умишлено нуклеазно двуверижно разкъсване. Прайм-редактирането започна като инструмент за малки корекции. Тази работа показва, че то може да изпълнява задачи по изграждане, за които досега са били нужни по-груби разрези. Пренасянето на тази възможност в медицината е отделен и по-дълъг процес, но демонстрираната способност е реална и нова.