Prime assembly vkládá DNA bez zlomů chromozomů

Editace genomu si dlouho lépe poradila s drobnými opravami než s vkládáním dlouhých úseků nové DNA. Technologie jako prime editing dokážou s chirurgickou přesností přepisovat jednotlivá písmena genetického kódu, s délkou zamýšlené změny však jejich možnosti rychle klesají. Řada metod pro vkládání větších úseků DNA navíc záměrně přerušuje obě vlákna chromozomu. Jde o účinný, ale hrubý zásah, který může vést k nechtěným delecím, přestavbám nebo chybnému spojení konců DNA. Článek v časopise Nature z 16. září popisuje metodu nazvanou prime assembly, která tuto mezeru vyplňuje: využívá aparát prime editingu k vložení externě dodané DNA a k rozsáhlým přestavbám chromozomů, aniž by záměrně vytvářela nukleázou navozený dvojvláknový zlom.

Zavedený nástroj dostává nové využití

Standardní prime editing funguje jako biologická obdoba funkce „hledat a nahradit“. Upravený protein Cas9 nařízne jedno vlákno DNA na naprogramovaném místě a enzym reverzní transkriptáza zkopíruje krátkou templátovou sekvenci z vodicí RNA přímo do chromozomu. Tento postup se osvědčuje při opravách jednotlivých písmen a krátkých inzercích, u větších úseků však naráží na své limity: vodicí RNA musí obsahovat celý templát a delší rozšíření jsou nestabilní (původní článek o prime editingu).

Prime assembly tento úkol rozděluje jinak. Editor stále nařízne jedno vlákno a zapíše do chromozomu krátké sekvence, ty ale slouží jako spojovací body pro samostatně dodaný, větší úsek donorové DNA. Vodicí RNA určuje místo integrace, donorová DNA nese to, co se má vložit. Cas9 přitom nařezává jen jedno vlákno, nikoli chromozom napříč oběma, takže metoda obchází rizika spojená s úplným přerušením chromozomu (Nature).

Tento rozdíl je důležitý i z jiného důvodu. Mnoho metod pro vkládání velkých úseků DNA závisí na opravě řízené homologií, což je buněčný proces probíhající převážně v aktivně se dělících buňkách. Tým ukázal, že prime assembly funguje i v nedělících se buňkách a v primárních lidských buňkách, tedy v buňkách získaných přímo od pacientů namísto dlouhodobého pěstování v laboratoři. Mnoho typů buněk, které chtějí klinici upravovat, například některé imunitní buňky nebo tkáně s pomalým buněčným dělením, se pro integrační editaci dosud obtížně využívalo (Nature).

Co metoda podle studie dokáže

Článek popisuje tři typy zásahů do genomu: překódování exonů, vložení transgenu a genomové přestavby v měřítku megabází. U překódování exonu stojí za to se zastavit. Exon je část genu, která kóduje úsek bílkoviny. Mnohá genetická onemocnění vznikají mutacemi rozptýlenými v témže exonu. Namísto návrhu opravy pro každou variantu zvlášť by tak výměna celého exonu za zdravou referenční kopii mohla umožnit řešit více mutací v tomto úseku jediným molekulárním návrhem (Nature). Autoři tuto možnost předvedli v buňkách, nikoli jako léčbu konkrétního onemocnění.

Existuje už několik dalších strategií pro vkládání DNA bez dvojvláknového zlomu. TwinPE koordinuje dvě vodicí RNA na protilehlých vláknech (Nature Biotechnology). PASTE vloží rekombinační místo a přivolá integrázu (Nature Biotechnology). Bridge recombinases využívají zcela odlišnou chemii řízenou RNA (Nature). Jiný tým v srpnu publikoval v časopise Nature Biotechnology metodu rovněž nazvanou „prime assembly“, která používá příbuzný, ale odlišný postup (Nature Biotechnology). Žádná z těchto metod nebyla porovnána za shodných podmínek, takže jejich pořadí podle účinnosti nebo kvality výsledného produktu zatím nelze určit.

Zářijový článek v Nature se od ostatních výsledků odlišuje kombinací vlastností, kterou uvádí: programovatelným zacílením, vkládáním externě dodané DNA střední až velké velikosti, fungováním v nedělících se buňkách a ukázkami v primárních lidských buňkách.

Co výsledek znamená a co ne

Jde o laboratorní výsledek z recenzované studie. Žádný pacient touto metodou léčen nebyl a údaje o bezpečnosti u lidí nejsou k dispozici. Přesnost výsledného produktu v místě editace, integrace mimo cílové místo ani dlouhodobá rizika nejsou v dostupných údajích kvantifikovány. Vyhnout se dvojvláknovému zlomu snižuje jedno známé riziko, neznamená to však, že je celý proces bez chyb.

Prime assembly vložil externě dodanou DNA a vytvořil rozsáhlé chromozomální přestavby v nedělících se a primárních lidských buňkách, a to bez záměrně vyvolaného dvojvláknového zlomu pomocí nukleázy. Prime editing začínal jako nástroj pro drobné opravy. Tato práce ukazuje, že zvládne i konstrukční zásahy, které dříve vyžadovaly hrubší přerušení DNA. Převést tuto schopnost do medicíny bude samostatný a delší projekt, předvedená možnost je však skutečná a nová.