Prime assembly lisab DNA-d kromosoome lõhkumata

Prime assembly lisab DNA-d kromosoomi, ilma kromosoome läbi lõikamata

Genoomi muutmine on seni suutnud teha väikseid parandusi paremini kui pikki uusi DNA-lõike lisada. Sellised tehnoloogiad nagu prime editing võivad üksikuid geneetilisi tähti kirurgilise täpsusega ümber kirjutada, kuid muutuse pikenedes jäävad nende võimalused napiks. Suurema DNA-lastiga integreerimismeetodid seevastu põhinevad sageli kromosoomi mõlema ahela teadlikul lõikamisel. See on tõhus, kuid jõuline võte, millega võivad kaasneda soovimatud deletsioonid, ümberkorraldused või valesti ühendatud DNA-otsad. 16. septembril avaldatud Nature’i artiklis kirjeldatakse meetodit nimega prime assembly, mis täidab selle lünga: see kasutab prime editingu masinavärki väljast lisatud DNA integreerimiseks ja suurte kromosoomi ümberkorralduste tekitamiseks, ilma et nukleaasi abil loodaks teadlikult kaheahelaline katkestus.

Vana redaktori uued ülesanded

Tavaline prime editing toimib bioloogilise otsi-ja-asenda käsuna. Muudetud Cas9-valk teeb programmeeritud kohas DNA ühte ahelasse sälgu ning pöördtranskriptaasiks nimetatav ensüüm kopeerib juht-RNA-lt pärineva lühikese matriitsi otse kromosoomi. See lähenemine sobib üksikute geneetiliste tähtede parandamiseks ja väikesteks lisandusteks, kuid suurema DNA-lasti puhul tekivad probleemid, sest kogu matriits tuleb kodeerida juht-RNA-sse ning pikemad laiendid muutuvad ebastabiilseks (prime editingu algne artikkel).

Prime assembly jagab töö teisiti. Redaktor teeb endiselt DNA ühte ahelasse sälgu ja kirjutab kromosoomi lühikesi järjestusi, kuid nüüd toimivad need ühenduskohtadena eraldi lisatavale suuremale doonor-DNA lõigule. Juht-RNA määrab, kuhu integratsioon toimub, doonor-DNA aga sisaldab sisestatavat materjali. Kuna Cas9 teeb sälgu ainult ühte ahelasse, mitte ei lõika mõlemat läbi, väldib meetod kromosoomi täieliku läbilõikamisega kaasnevaid riske (Nature).

Erinevus on oluline ka teisel põhjusel. Paljud suure DNA-lõigu sisestamise meetodid sõltuvad homoloogial põhinevast DNA-parandusest, mis toimub peamiselt aktiivselt jagunevates rakkudes. Töörühm näitas, et prime assembly toimib ka mittejagunevates ja inimese primaarsetes rakkudes. Need on rakud, mida teadlased eraldavad otse patsientidelt, selle asemel et neid laboris lõputult kasvatada. Paljusid kliinikus olulisi rakutüüpe, näiteks teatud immuunrakke ja harva jagunevaid kudesid, on integratsioonipõhise geenimuutmisega olnud raske sihtida (Nature).

Mida meetodiga näidati

Artiklis kirjeldatakse kolme tüüpi genoomi muutmist: eksoni ümberkodeerimine, transgeeni sisestamine ja megabaidi suurusjärgus genoomi ümberkorraldused. Eksoni ümberkodeerimine vajab eraldi selgitust. Ekson on geeni osa, mis kodeerib osa valgust. Paljud geneetilised haigused tekivad sama eksoni eri kohtades paiknevatest mutatsioonidest. Ühe mutatsiooni jaoks eraldi paranduse kavandamise asemel võiks kogu eksoni asendamine terve referentskoopiaga võimaldada ühe molekulaarse lahendusega parandada mitut selles lõigus paiknevat mutatsiooni (Nature). Töörühm näitas seda rakkudes meetodi võimekusena, mitte ühegi haiguse ravina.

Mitmed teised kaheahelalise katkestuseta integratsioonimeetodid on juba olemas. TwinPE koordineerib kaht vastassuunalistel ahelatel paiknevat juht-RNA-d (Nature Biotechnology). PASTE paigaldab rekombinatsioonisaidi ja kaasab integraasi (Nature Biotechnology). Bridge recombinases kasutab hoopis teistsugust RNA-juhitud keemiat (Nature). Üks teine töörühm avaldas augustis ajakirjas Nature Biotechnology samuti meetodi nimega „prime assembly”, mis kasutab sellega seotud, kuid erinevat strateegiat (Nature Biotechnology). Neid meetodeid pole võrreldavates tingimustes kõrvutatud, seega on nende tõhususe või tulemuse kvaliteedi põhjal pingeritta seadmine ennatlik.

Septembris ajakirjas Nature avaldatud töö ühendab autorite kirjeldusel neli omadust: programmeeritav sihtimine, keskmise kuni suure väljast lisatud DNA-lasti integreerimine, toimimine mittejagunevates rakkudes ja katsetamine inimese primaarsetes rakkudes.

Mida see tähendab ja mida mitte

Tegu on eelretsenseeritud laboriuuringu tulemusega. Ühtki patsienti pole ravitud ja inimeste kohta käivaid ohutusandmeid pole. Muutmiskoha täpsus, sihtmärgiväline integratsioon ja pikaajalised riskid on avalikult kättesaadavate andmete põhjal endiselt kvantifitseerimata. Kaheahelalise katkestuse vältimine vähendab üht teadaolevat riski, kuid ei muuda protsessi veatuks.

Prime assembly on integreerinud väljast lisatud DNA-d ja tekitanud suuri kromosoomi ümberkorraldusi nii mittejagunevates kui ka inimese primaarsetes rakkudes, ilma et nukleaasi abil oleks teadlikult tekitatud kaheahelaline katkestus. Prime editing sai alguse väikeste paranduste tööriistana. See töö näitab, et seda saab kasutada ka suuremahulisteks genoomimuudatusteks, milleks oli varem vaja ebatäpsemaid lõikeid. Selle võimekuse viimine meditsiinipraktikasse on eraldi ja pikem arendusülesanne, kuid näidatud võimekus on uus ja tegelik.