Prime assembly lisää DNA:ta katkomatta kromosomeja

Genomin muokkauksessa pienet korjaukset ovat jo pitkään onnistuneet paremmin kuin pitkien uusien DNA-jaksojen lisääminen. Prime editing -tekniikalla yksittäisiä geneettisiä kirjaimia voidaan vaihtaa tarkasti, mutta tekniikan ongelmat kasvavat muutoksen pidentyessä. Monet suurempien DNA-jaksojen liittämiseen käytetyt menetelmät puolestaan katkaisevat kromosomin molemmat DNA-juosteet. Voimakas mutta karkea keino voi aiheuttaa ei-toivottuja deleetioita, uudelleenjärjestelyjä tai väärin liittyneitä DNA-päitä. Nature-lehdessä 16. syyskuuta julkaistu tutkimus esittelee prime assembly -menetelmän, joka yhdistää nämä kaksi lähestymistapaa: se käyttää prime editing -koneistoa solun ulkopuolelta toimitetun DNA:n liittämiseen ja suurten kromosomijärjestelyjen tuottamiseen ilman tarkoituksellista nukleaasin aiheuttamaa kaksijuostekatkoa.

Vanhalle muokkaustekniikalle uusi tehtävä

Tavallinen prime editing toimii biologisen haku ja korvaa -toiminnon tavoin. Muokattu Cas9-proteiini tekee DNA:n toiseen juosteeseen yksijuostekatkon ohjelmoidussa kohdassa. Käänteiskopioijaentsyymi kopioi sen jälkeen ohjaus-RNA:n sisältämän lyhyen mallijakson suoraan kromosomiin. Menetelmä sopii yksittäisten kirjainten korjaamiseen ja pieniin lisäyksiin, mutta suurempien DNA-jaksojen kanssa se vaikeutuu, koska ohjaus-RNA:n pitäisi sisältää koko mallijakso ja pitkät jatkeet muuttuvat epävakaiksi (alkuperäinen prime editing -tutkimus).

Prime assembly jakaa tehtävän toisin. Muokkausentsyymi tekee edelleen yksijuostekatkon ja kirjoittaa kromosomiin lyhyitä DNA-jaksoja. Ne toimivat nyt liitoskohtina erikseen toimitettavalle, suuremmalle luovuttaja-DNA:lle. Ohjaus-RNA määrittää, mihin kohtaan liitos tehdään, ja luovuttaja-DNA sisältää lisättävän aineksen. Cas9 katkaisee vain toisen DNA-juosteen eikä halkaise kromosomia kokonaan, joten menetelmä välttää kaksijuostekatkoihin liittyviä riskejä (Nature).

Ero on tärkeä myös toisesta syystä. Monet suurten DNA-jaksojen liittämiseen tarkoitetut menetelmät perustuvat homologiaohjattuun korjaukseen, solun omaan korjausprosessiin, joka toimii pääasiassa jakautuvissa soluissa. Tutkijat osoittivat prime assemblyn toimivan myös jakautumattomissa soluissa ja primaarisissa ihmisen soluissa. Primaarisolut eristetään suoraan potilaasta, eikä niitä kasvateta rajattomasti laboratoriossa. Juuri monet kliinisesti kiinnostavat solutyypit, kuten tietyt immuunisolut ja harvoin jakautuvat kudossolut, ovat olleet vaikeita kohteita integraatioon perustuvassa genomin muokkauksessa (Nature).

Mihin menetelmä pystyy

Tutkimuksessa raportoidaan kolme genomin muokkauksen käyttötapaa: eksonin uudelleenkoodaus, siirtogeenin liittäminen ja megabaasien mittaiset genomin uudelleenjärjestymät. Eksoni on geenin osa, joka sisältää ohjeen osaan proteiinista. Monet perinnölliset sairaudet johtuvat saman eksonin eri kohdissa sijaitsevista mutaatioista. Sen sijaan että jokaiselle mutaatiolle suunniteltaisiin oma korjaus, koko eksoni voitaisiin korvata terveellä vertailukopiolla. Yksi molekyylirakenne voisi silloin kattaa useita saman DNA-jakson mutaatioita (Nature). Tutkimuksessa osoitettiin soluihin liittyvä tekninen mahdollisuus, ei sairauden hoitoa.

Myös muita kaksijuostekatkoja välttäviä menetelmiä on jo kehitetty. TwinPE koordinoi kahta ohjaus-RNA:ta DNA:n vastakkaisilla juosteilla (Nature Biotechnology). PASTE asentaa rekombinaatiokohdan ja kutsuu paikalle integraasientsyymin (Nature Biotechnology). Bridge-rekombinaasit käyttävät kokonaan toisenlaista RNA-ohjattua kemiaa (Nature). Toinen tutkimusryhmä julkaisi elokuussa Nature Biotechnology -lehdessä niin ikään prime assembly -nimisen menetelmän, joka perustuu samankaltaiseen mutta erilliseen ratkaisuun (Nature Biotechnology). Menetelmiä ei ole verrattu samoissa koeolosuhteissa, joten niiden tehokkuudesta tai tuotosten laadusta ei vielä voi tehdä paremmuusjärjestystä.

Syyskuussa Nature-lehdessä julkaistun tutkimuksen erityispiirre on yhdistelmä, jonka se tutkijoiden mukaan osoittaa: ohjelmoitava kohdennus, keskikokoisten ja suurten ulkopuolelta toimitettujen DNA-jaksojen liittäminen, toiminta jakautumattomissa soluissa sekä kokeet primaarisilla ihmisen soluilla.

Mitä tulos tarkoittaa – ja mitä ei

Kyse on vertaisarvioidusta laboratoriotutkimuksesta. Yhtäkään potilasta ei ole hoidettu, eikä ihmisistä ole saatavilla turvallisuustietoja. Muokkauskohdan tarkkuutta, kohteen ulkopuolista DNA:n integroitumista ja pitkäaikaisriskejä ei ole käytettävissä olevien tietojen perusteella määritetty. Kaksijuostekatkon välttäminen pienentää yhtä tunnettua vaaraa, mutta ei tee menetelmästä virheetöntä.

Prime assemblylla on liitetty solun ulkopuolelta toimitettua DNA:ta ja tuotettu suuria kromosomijärjestelyjä jakautumattomissa ja primaarisissa ihmisen soluissa ilman suunniteltua nukleaasin aiheuttamaa kaksijuostekatkoa. Prime editing kehitettiin alun perin pienten korjausten työkaluksi. Tutkimus osoittaa, että sillä voidaan tehdä myös rakenteellisia muokkauksia, joihin on aiemmin tarvittu karkeampia katkaisuja. Kyky ei vielä ole lääketieteellinen hoito. Sen muuttaminen sellaiseksi vaatii erillisen ja huomattavasti pidemmän kehitystyön.