Prime assembly įterpia DNR, neperkirpdama chromosomų

Prime assembly įterpia DNR neperkirpdama chromosomų

Genomo redagavimo technologijos ilgą laiką geriau tiko nedidelėms pataisoms nei didelėms naujos DNR atkarpoms įterpti. Tokios technologijos kaip prime editing gali labai tiksliai perrašyti pavienes DNR „raides“, tačiau sunkiai susidoroja su didesniais pakeitimais. Tuo metu dauguma metodų, skirtų didesnei DNR sekai į genomą įterpti, sąmoningai perkerpa abi chromosomos DNR grandines. Tai galingas, bet grubus būdas, galintis sukelti nepageidaujamus ištrynimus, persitvarkymus arba netinkamai sujungtus DNR galus. Rugsėjo 16 d. žurnale Nature paskelbtame straipsnyje aprašomas metodas, pavadintas prime assembly, užpildantis šią spragą: jis naudoja prime editing mechanizmą iš išorės pateiktai DNR įterpti ir didelio masto chromosomų pertvarkoms sukelti, tyčia nesukeldamas nukleazės sukeliamo dvigrandžio DNR lūžio.

Prime editing pritaikytas didesniems pakeitimams

Įprastas prime editing veikia panašiai kaip biologinis paieškos ir keitimo mechanizmas. Modifikuotas Cas9 baltymas užprogramuotoje vietoje įkerpa vieną DNR grandinę, o atvirkštinė transkriptazė pagal trumpą kreipiančiojoje RNR esančią matricą naują seką įrašo tiesiai į chromosomą. Šis metodas tinka pavienėms „raidėms“ pataisyti ir nedidelėms sekoms įterpti, tačiau susiduria su didesnio DNR intarpo problema: kreipiančiojoje RNR turi būti užkoduota visa matrica, o ilgesnės įterpiamos sekos tampa nestabilios (originaliame prime editing straipsnyje).

Prime assembly užduotį padalija kitaip. Redagavimo sistema vis dar įkerpa vieną grandinę ir įrašo į chromosomą trumpas sekas, tačiau šios sekos tampa jungties taškais atskirai pateikiamai didesnei donoro DNR atkarpai. Kreipiančioji RNR nurodo, kur įvyks įterpimas, o donoro DNR – kokia seka bus įterpta. Kadangi Cas9 įkerpa tik vieną grandinę, o ne perkerpa abi, metodas išvengia rizikų, susijusių su visišku chromosomos DNR atskyrimu (Nature).

Šis skirtumas svarbus ir dėl kitos priežasties. Daugelis didelių DNR intarpų įterpimo metodų remiasi homologiškai nukreiptu taisymu – ląstelės procesu, daugiausia vykstančiu aktyviai besidalijančiose ląstelėse. Tyrėjai parodė, kad prime assembly veikia ir nesidalijančiose, ir pirminėse žmogaus ląstelėse, tai yra tiesiogiai iš pacientų paimtose ląstelėse, o ne neribotą laiką laboratorijoje auginamose ląstelėse. Integracija grindžiamam redagavimui iki šiol buvo sunku taikyti daugelį klinikiniu požiūriu svarbių ląstelių tipų, įskaitant kai kurias imunines ląsteles ir retai besidalijančių audinių ląsteles (Nature).

Ką šis metodas leido padaryti

Straipsnyje aprašomos trys genomo manipuliacijų kategorijos: egzonų perkodavimas, transgeno įterpimas ir megabazių masto genomo pertvarkymai. Ties egzonų perkodavimu verta stabtelėti. Egzonas – viena geno atkarpa, koduojanti dalį baltymo. Daugelį genetinių ligų sukelia mutacijos, išsibarsčiusios tame pačiame egzone. Užuot kiekvienam variantui kūrus atskirą pataisą, visą egzoną pakeitus sveika etalonine kopija, viena molekulinė konstrukcija galėtų ištaisyti kelias toje atkarpoje esančias mutacijas (Nature). Straipsnyje tai pademonstruota kaip galimybė ląstelėse, o ne kaip kurios nors ligos gydymas.

Jau egzistuoja ir keletas kitų integracijos nesukeliant DNR lūžio strategijų. TwinPE koordinuoja dvi į priešingas DNR grandines nukreiptas RNR (Nature Biotechnology). PASTE įdiegia rekombinacijos vietą ir pasitelkia integrazę (Nature Biotechnology). Bridge recombinases naudoja visiškai kitokią RNR valdomą chemiją (Nature). Kita tyrėjų grupė rugpjūtį žurnale Nature Biotechnology paskelbė metodą, taip pat pavadintą „prime assembly“, kuriame taikoma susijusi, bet kitokia strategija (Nature Biotechnology). Nė vienas iš šių metodų nebuvo lygintas vienodomis sąlygomis, todėl per anksti juos rikiuoti pagal efektyvumą ar gaunamo produkto kokybę.

Rugsėjo mėnesį žurnale Nature paskelbto tyrimo išskirtinumas – derinamos keturios savybės: programuojamas nukreipimas į pasirinktą vietą, vidutinio ir didelio dydžio iš išorės pateikiamos DNR sekos įterpimas, veikimas nesidalijančiose ląstelėse ir bandymai su pirminėmis žmogaus ląstelėmis.

Ką tai reiškia ir ko nereiškia

Tai recenzuotas laboratorinis rezultatas. Nė vienas pacientas nebuvo gydytas, o duomenų apie saugumą žmonėms nėra. Viešai prieinamoje informacijoje kol kas neįvertinti redagavimo rezultato tikslumas pasirinktoje vietoje, DNR integracija ne taikinio vietoje ir ilgalaikė rizika. Dvigrandžio DNR lūžio išvengimas sumažina vieną žinomą pavojų, tačiau dėl to procesas netampa be klaidų.

Prime assembly integravo iš išorės pateiktą DNR ir nesidalijančiose bei pirminėse žmogaus ląstelėse sukėlė didelio masto chromosomų pertvarkas, tyčia nesukeliant nukleazės sukeliamo dvigrandžio DNR lūžio. Prime editing buvo sukurtas kaip įrankis nedidelėms pataisoms. Šis darbas rodo, kad technologija gali atlikti ir didesnes DNR konstravimo užduotis, kurioms anksčiau reikėjo grubesnio chromosomos perkirpimo. Pritaikyti šią galimybę medicinoje bus atskiras ir ilgesnis darbas, tačiau pats pademonstruotas technologijos gebėjimas yra realus ir naujas.