Prime assembly ugrađuje DNK bez rezanja kromosoma

Uređivanje genoma dosad je bilo mnogo uspješnije u ispravljanju malih pogrešaka nego u umetanju velikih odsječaka nove DNA. Tehnologije poput prime editinga mogu kirurškom preciznošću promijeniti pojedinačna slova genetskog koda, ali teško svladavaju promjene većeg opsega. Mnoge metode za ugradnju većeg odsječka DNA oslanjaju se na namjerno presijecanje obaju lanaca kromosoma. To je snažan, ali grub zahvat koji može izazvati neželjena brisanja, preslagivanja ili pogrešno spojene krajeve DNA. U radu objavljenom 16. rujna u časopisu Nature opisana je metoda nazvana prime assembly, koja popunjava taj procjep: koristi mehanizam prime editinga za ugradnju izvana dodane DNA i stvaranje velikih preslagivanja kromosoma, bez namjernog stvaranja loma obaju lanaca DNA koji bi izazvala nukleaza.

Prime editor dobiva nove mogućnosti

Standardno prime editing funkcionira poput biološke naredbe „traži i zamijeni“. Modificirani protein Cas9 zarezuje jedan lanac DNA na programiranom mjestu, a enzim reverzna transkriptaza prepisuje kratki predložak iz vodičke RNA izravno u kromosom. Taj je pristup elegantan za ispravke pojedinačnih slova i mala umetanja, ali kod većeg tereta DNA nailazi na ograničenja jer vodička RNA mora sadržavati cijeli predložak, a dulji nastavci postaju nestabilni (izvorni rad o prime editingu).

Prime assembly taj posao dijeli na dva dijela. Sustav i dalje zarezuje jedan lanac i u kromosom upisuje kratke sekvence, ali one sada služe kao spojne točke za zasebno pripremljeni veći odsječak donorske DNA. Vodička RNA određuje mjesto ugradnje, a donorska DNA sadrži ono što se umeće. Budući da Cas9 zarezuje samo jedan lanac, a ne presijeca oba, metoda izbjegava rizike povezane s potpunim presijecanjem kromosoma (Nature).

Ta je razlika važna i zato što se mnoge metode ugradnje većih odsječaka oslanjaju na popravak DNA usmjeren homologijom, stanični proces uglavnom ograničen na stanice koje se aktivno dijele. Tim je pokazao da prime assembly djeluje i u stanicama koje se ne dijele te u primarnim ljudskim stanicama, kakve istraživači uzimaju izravno od pacijenata, umjesto da ih neograničeno uzgajaju u laboratoriju. Mnoge vrste stanica koje kliničari žele uređivati, uključujući određene imunosne stanice i tkiva koja se rijetko dijele, dosad su bile teško dostupne metodama uređivanja koje se temelje na ugradnji (Nature).

Što je metoda pokazala da može

U radu se navode tri skupine zahvata na genomu: prekodiranje egzona, ugradnja transgena i preslagivanja genoma na razini megabaza. Egzon je jedan odsječak gena koji kodira dio proteina. Mnoge genetske bolesti proizlaze iz mutacija raspršenih unutar istog egzona. Umjesto osmišljavanja posebnog popravka za svaku varijantu, zamjena cijelog egzona zdravom referentnom kopijom mogla bi omogućiti da jedan molekularni dizajn obuhvati više mutacija na tom odsječku (Nature). To je u stanicama pokazano kao mogućnost, a ne kao liječenje neke bolesti.

Već postoji nekoliko drugih strategija za ugradnju DNA bez stvaranja loma. TwinPE koordinira dvije vodičke RNA na suprotnim lancima (Nature Biotechnology). PASTE ugrađuje mjesto za rekombinaciju i dovodi integrazu (Nature Biotechnology). Bridge rekombinaze koriste posve drukčiju kemiju vođenu RNA-om (Nature). Drugi je tim u kolovozu u časopisu Nature Biotechnology objavio metodu koja se također zove „prime assembly“, ali se služi srodnom, premda drukčijom strategijom (Nature Biotechnology). Nijedan od tih pristupa nije uspoređen pod istim uvjetima, pa je prerano svrstavati ih prema učinkovitosti ili kakvoći rezultata.

Ono što rujanski rezultat u časopisu Nature izdvaja jest kombinacija koju autori navode: programabilno ciljanje, ugradnja srednje velikih i velikih odsječaka izvana dodane DNA, djelovanje u stanicama koje se ne dijele te pokusi na primarnim ljudskim stanicama.

Što to znači i što ne znači

Ovo je rezultat recenziranog laboratorijskog istraživanja. Nijedan pacijent nije liječen, a podaci o sigurnosti u ljudi ne postoje. U dostupnoj dokumentaciji još nema kvantifikacije preciznosti ishoda na mjestu uređivanja, ugradnje izvan ciljnog mjesta ni dugoročnih rizika. Izbjegavanje loma obaju lanaca smanjuje jedan poznati rizik, ali postupak zbog toga nije bez pogrešaka.

Metodom prime assembly u stanice koje se ne dijele i primarne ljudske stanice ugrađena je izvana dodana DNA, a proizvedena su i velika preslagivanja kromosoma, bez namjernog loma obaju lanaca DNA koji bi izazvala nukleaza. Prime editing počeo je kao alat za male ispravke. Ovaj rad pokazuje da taj sustav može obaviti složenije zahvate na genomu koji su prije zahtijevali grublje rezove. Pretvaranje te mogućnosti u medicinsku primjenu zaseban je i dugotrajniji projekt, ali riječ je o stvarnoj novoj mogućnosti.