Prime assembly vstavi DNK brez pretrganja kromosomov

Urejanje genoma je bilo doslej uspešnejše pri majhnih popravkih kot pri vstavljanju dolgih odsekov nove DNK. Tehnologije, kot je prime editing, lahko posamezne genetske črke prepišejo z veliko natančnostjo, vendar se pri daljših spremembah hitro pokažejo njihove omejitve. Številne metode za vgradnjo večjega genskega tovora temeljijo na namernem pretrganju obeh verig DNK v kromosomu, kar je učinkovito, vendar grobo in lahko povzroči neželene delecije, preureditve ali napačno spojene konce DNK. V članku, ki je bil 16. septembra objavljen v reviji Nature, je opisana metoda prime assembly, ki zapolnjuje to vrzel: uporablja mehanizem prime editinga za vgradnjo ločeno pripravljenega odseka DNK in omogoča velike kromosomske preureditve, ne da bi pri tem z nukleazo namerno povzročila dvoverižni prelom DNK, pri katerem se pretrgata obe njeni verigi.

Nova naloga za stari urejevalnik

Standardni prime editing deluje kot biološka različica ukaza »poišči in zamenjaj«. Spremenjena beljakovina Cas9 na programiranem mestu naredi zarezo v eni verigi DNK, encim reverzna transkriptaza pa kratko predlogo iz vodilne RNK prepiše neposredno v kromosom. Pri popravljanju posameznih genetskih črk in majhnih vstavkih je pristop zelo natančen, pri večjem tovoru pa naleti na omejitve, saj mora vodilna RNK kodirati celotno predlogo, daljši podaljški pa postanejo nestabilni (izvirni članek o prime editingu).

Prime assembly nalogo razdeli drugače. Urejevalnik še vedno naredi zarezo v eni verigi DNK in v kromosom zapiše kratka zaporedja, vendar ta zdaj služijo kot stična mesta za večji odsek donorske DNK, ki ga dodajo ločeno. Vodilna RNK določi mesto vgradnje, donorska DNK pa vsebuje vsebino vstavka. Ker Cas9 zareže le eno verigo, ne pa obeh, se metoda izogne tveganjem, povezanim s popolnim pretrganjem kromosoma (Nature).

Razlika je pomembna tudi zato, ker se številne metode za vgradnjo velikih odsekov opirajo na homologno usmerjeno popravljanje, celični proces, ki je večinoma omejen na celice v aktivni delitvi. Raziskovalna skupina je pokazala, da prime assembly deluje v nedelitečih se celicah in primarnih človeških celicah, ki jih raziskovalci pridobijo neposredno od bolnikov, namesto da bi jih neomejeno dolgo gojili v laboratoriju. Med tipi celic, ki jih zdravniki najbolj želijo urejati, so nekatere imunske celice in celice v tkivih, ki se redko delijo; pri metodah, temelječih na vgradnji, jih je bilo doslej težko doseči (Nature).

Kaj so z metodo pokazali

Članek opisuje tri vrste posegov v genom: prekodiranje eksonov, vstavitev transgena, dodatnega genskega zapisa, in preureditve genoma v merilu megabaz oziroma milijonov baznih parov. Prekodiranje eksonov zahteva kratko pojasnilo. Ekson je odsek gena, ki vsebuje zapis za del beljakovine. Številne genetske bolezni povzročajo mutacije, ki so razpršene po istem eksonu. Namesto priprave posebnega popravka za vsako različico bi lahko celoten ekson zamenjali z zdravo referenčno kopijo; ena molekularna zasnova bi tako lahko zajela več mutacij na tem odseku (Nature). To so v celicah pokazali kot eno od zmožnosti metode, ne kot zdravljenje katere koli bolezni.

Obstaja že več drugih strategij za vgradnjo DNK brez pretrganja obeh verig. TwinPE usklajuje dve vodilni RNK na nasprotnih verigah (Nature Biotechnology). PASTE vstavi mesto rekombinacije in pritegne integrazo (Nature Biotechnology). Rekombinaze Bridge uporabljajo povsem drugačen kemični mehanizem, ki ga usmerja RNK (Nature). Druga skupina je avgusta v reviji Nature Biotechnology objavila metodo, prav tako imenovano »prime assembly«, ki temelji na sorodni, vendar drugačni strategiji (Nature Biotechnology). Raziskovalci teh pristopov še niso primerjali v primerljivih pogojih, zato je prezgodaj razvrščati njihovo učinkovitost ali kakovost nastalih produktov.

Septembrska objava v reviji Nature se od drugih pristopov razlikuje po kombinaciji štirih lastnosti: programirljivega ciljanja, vgradnje ločeno pripravljenih odsekov DNK srednje do velikega obsega, delovanja v nedelitečih se celicah in prikaza delovanja v primarnih človeških celicah.

Kaj to pomeni in česa ne

Gre za laboratorijski izsledek iz recenzirane raziskave. Metode pri nobenem bolniku še niso uporabili, podatkov o varnosti pri ljudeh pa ni. Javno dostopni podatki še ne omogočajo količinske ocene natančnosti nastalih sprememb na mestu urejanja, vgradnje DNK zunaj ciljnega mesta ali dolgoročnih tveganj. To, da metoda ne povzroči dvoverižnega preloma, zmanjša eno znano tveganje, vendar zaradi tega postopek ni brez napak.

Metoda prime assembly je v nedelitečih se in primarnih človeških celicah vgradila ločeno pripravljeno DNK ter ustvarila velike kromosomske preureditve, ne da bi pri tem z nukleazo namerno povzročila dvoverižni prelom. Prime editing je bil sprva orodje za majhne popravke. Ta raziskava kaže, da zmore tudi večje posege v genom, pri katerih so bili doslej potrebni bolj grobi rezi. Prenos te zmožnosti v medicino bo ločen in daljši razvojni projekt, vendar je zmožnost, ki so jo pokazali, dejanska novost.